Eine erste Anstellung fand Louis Pasteuer im Jahre 1848 als Gymnasialprofessor für Physik am Lycée von Dijon. Diese Tätigkeit übte er allerdings nur sehr kurz aus. Bereits Anfang 1849 wechselte er den Job und wurde Assistenzprofessor für Chemie an der Universität von Straßburg.
Hier verliebte er sich in Marie Laurent, die Tochter des Rektors der Akademie Straßburg. Er heiratete sie bereits am 29. Mai 1849. Seine Frau brachte fünf Kinder zur Welt, von denen allerdings drei in früher Jugend starben.
Bereits im Jahre 1853 war Louis Pasteuer als Wissenschaftler hoch anerkannt. Von der Pharmazeutische Gesellschaft bekam er aufgrund seiner Leistungen ein Preisgeld von 1500 Francs zugesprochen und wurde zudem Mitglied der Ehrenlegion.
Im Jahre 1854 entstand die Fakultät für Wissenschaften in Lille, deren Professor für Chemie er wurde. Seion Verdienst war es, dass die naturwissenschaftlichen Studenten nun wesentlich praxisorientierter (z. B. mit Laborarbeit) ausgebildet wurden. Für seine Zeit galt er hinsichtlich der Lehrtätigkeit als ser innovativ.
Im Jahre 1857 ernannte man ihn zum Direktor für wissenschaftliche Studien und zum Administrator an der École Normale in Paris. Von ihm wurde dort die Zahl der Laborassistenten deutlich erhöht, die Vertragsdauer aber gleichzeitig herabgesetzt. Er wollte damit mehr Studenten zur Promotion motivieren. In dieser Zeit wurde von ihm zudem die Fachzeitschrift "Annales scientifiques de l’École Normale Supérieure" gegründet, wo er seine Forschungsergebnisse veröffentlichte.
1862 wurde er in die Akademie der Wissenschaften gewählt. Ab dem Jahre 1865 widmete er sich der Erforschung der Seidenraupen. Diesen Auftrag hatte er von der französischen Regierung erhalten. An diesem Auftrag, der ihn vor allem im Sommer sehr stark einband, arbeitete er bis ins Jahr 1870.
Im Jahre 1867 erfolgte ein beruflicher Wechsel als Chemie-Professor an die Sorbonne. Der Grund lag auch daran, dass er aufgrund der Studentenproteste an seiner vorherigen Universität den Hut nahm.
Pasteur hatte aufgrund seiner Fähigkeiten einen sehr guten Draht zu Kaiser Napoleon III. Von diesem wurde ihm ein Neubau eines Labors genehmigt. Durch den Deutsch-Französischen Krieg (1870 bis 1871) verzögerte sich der Bau jedoch. Während des Kriegsjahres widmete er sich dem Bierbrauen in seiner Heimat. Aufgrund der kriegerischen Auseinandersetzungen seines Heimatlandes mit Deutschland gab er einen Ehrendoktortitel der Universität Bonn 1870 zurück.
Nach Kriegsende kehrte er in die Hauptstadt Paris zurück. Nun äußerte er den Wunsch, von der Lehrtätigkeit entbunden zu werden. Nun wollte er seine Forschungen über Gärung, Bierbrauen, Erkrankungen der Seidenraupen sowie die spontane Entstehung des Lebens beenden.
Im Jahre 1875 soll Louis Pasteur sich auch als Lokalpolitiker versucht haben, scheiterte jedoch angeblich bei der Wahl um einen Abgeordnetensitz für die konservative Partei in seinem Heimatort Arbois. Dies ist jedoch leider nicht genau belegt.
Im Alter von 54 Jahren, also 1876 fand er ein weiteres Forschungsgebiet, welches nun in seinen Fokus rückte. Nun beschäftigte er sich mit Infektionskrankheiten von Haustieren und beim Menschen. Nun wollte er ein Mittel gegen Milzbrand entwickeln. Tatsächlich gelang ihm die Herstellung eines Impfstoffes. Um diesen produzieren zu können, erfolgte der Bau eines zusätzlichen Labores in der rue Vauquelin. Damit war ein neuer Wirtschaftszweig, die Impfstoff-Industrie geboren. Neben dem Milzbrand wirdmete sich Louis Pasteur auch der Erforschung von Tollwut.